到目前為止，非自然光催化反應(yīng)僅限于整體還原和氧化還原中性過程。

在此，來自美國匹茲堡大學的劉鵬&美國加州大學圣巴巴拉分校的楊揚等研究者報道了光生物催化有機硼試劑與氨基酸之間的不對稱sp³–sp³氧化交叉偶聯(lián)。相關(guān)論文以題為“Stereoselective amino acid synthesis by photobiocatalytic oxidative coupling”于2024年05月01日發(fā)表在Nature上。

據(jù)悉，這早已不是二人的第一次強強聯(lián)手，僅在2023年兩人就曾聯(lián)手發(fā)了一篇Science以及一篇Nature Catalysis。不完全統(tǒng)計，此前兩人更聯(lián)手發(fā)過，諸如JACS(2022年2篇)、Science(2021年1篇)等頂刊。

在過去的幾年里，利用可見光揭示了以前虛幻的酶活性，對非自然光生物催化的研究在一系列立體選擇性C-C鍵形成自由基過程中達到了高峰，這對手性小分子催化劑來說仍然是一個挑戰(zhàn)。

值得注意的是，通過利用煙酰胺、黃素和吡哆醛-5 ‘ -磷酸依賴酶的催化亂交性，促進了整體的還原和氧化還原中性自由基轉(zhuǎn)化，允許分子間自由基加成烯烴和sp³–sp³交叉親電偶聯(lián)發(fā)生，并具有良好的對映體控制。

然而，盡管親核試劑的結(jié)構(gòu)多樣性和廣泛可用性，兩種不同的親核試劑的氧化C(sp³)-C (sp³)交叉偶聯(lián)在新的自然光生物催化中仍然未知(圖1a)。如果成功實現(xiàn)，不對稱光生物催化sp³–sp³氧化偶聯(lián)將為從豐富的構(gòu)建塊中獲得過多的增值手性產(chǎn)品提供方便。

圖1 光生物催化不對稱sp³–sp³氧化交叉偶聯(lián)的協(xié)同三催化循環(huán)。

在研究者小組設(shè)計立體選擇性自由基生物催化新策略的之前努力中，研究者最近質(zhì)疑是否可以推進新的生物催化激活模式來促進sp³–sp³氧化交叉偶聯(lián)，這在有機合成化學或酶學中都是未知的。

鑒于天然磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)依賴酶具有巨大的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，研究者對解鎖廣泛使用的PLP生物催化劑的新的氧化自由基偶聯(lián)活性特別感興趣，這些生物催化劑用于立體選擇性合成非規(guī)范氨基酸(ncAAs)。

ncAAs廣泛應(yīng)用于臨床重要的肽治療、生物活性天然產(chǎn)物和功能性非天然蛋白質(zhì)中，是一類有價值的化合物，其立體選擇性合成長期以來一直吸引著合成化學家和合成生物學家。在自然界中，PLP酶通過羰基催化作用，在氨基酸底物的α、β和γ位置通過雙電子機制促進多種ncAAs的構(gòu)建和破壞。

直到最近，自由基PLP酶僅限于天然的[4Fe-4S]/SAM和B12依賴的PLP氨基轉(zhuǎn)化酶和O₂依賴的PLP氧化酶，底物范圍很窄。在2023年，研究者的團隊描述了一種新的非自然光生物催化形式，其中研究者利用可見光光氧化還原催化劑和酶的合作相互作用來開啟PLP依賴性色氨酸合成酶的非自然自由基反應(yīng)活性，用于絲氨酸和蘇氨酸的β-去羥基交叉偶聯(lián)。

研究者假設(shè)，如果另一個不同的α-功能化PLP酶家族，包括蘇氨酸醛縮酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、蘇氨酸轉(zhuǎn)醛縮酶(TTAs)及其相關(guān)的生物合成酶，可以被重新利用并進化為sp³–sp³氧化偶聯(lián)，這將使研究者能夠推進一種前所未有的吡啶醛自由基生物催化模式，用于立體選擇性和無保護基團的ncAAs合成。包括那些帶有連續(xù)立體中心和α-四取代立體中心的，這些仍然是催化不對稱合成所不能達到的(圖1b)。

在此，研究者提出的通過光氧化還原-吡哆醛生物催化(I + II→III)進行sp³–sp³氧化偶聯(lián)的三重催化循環(huán)，詳細描述如圖1c所示。在可見光照射下，(fac)-Ir(ppy)₃ (ppy = 2-苯基吡啶，IV)會吸收一個光子，提供一個長壽命的激發(fā)態(tài)還原劑(fac)-*Ir(ppy)₃ (IV*，E_1/2 (*Ir^III/Ir^IV) = – 1.73 V，相對于CH₃CN中的飽和甘汞電極(SCE))。

(fac)-*Ir(ppy)₃將被[Co(NH₃)₆]³⁺ (V, E_1/2 (Co^III/Co^II)與SCE在H₂O)中迅速氧化，得到(fac)-Ir(ppy)³⁺ (VI)作為強氧化劑(E_1/2 (Ir^IV/Ir^III=0.77 V)，相對于CH₃CN中的SCE。由于還原后的[Co(NH₃)₆]²⁺ (VII)的配體穩(wěn)定性增加，與H₂O的快速配體交換將形成[Co(H₂O)₆]²⁺ (E_1/2 (Co^III/Co^II) = 1.68 V，相對于H₂O中的SCE)中不能被(fac)-Ir(ppy)³⁺ (VI)再氧化。

有機硼底物(I)與VI的單電子氧化，將提供瞬態(tài)碳中心自由基VIII并再生(fac)-Ir(ppy)₃光催化劑(IV)。在生物催化循環(huán)中，依賴PLP的α-功能化酶IX，如蘇氨酸醛縮酶，首先與豐富的氨基酸底物II進行傳遞，形成外部醛胺X。

PLP結(jié)合會導致α-質(zhì)子的顯著pKa降低，從而導致關(guān)鍵的類醌中間體(XI)的快速去質(zhì)子化。在這個關(guān)鍵階段，光催化形成的自由基物種VIII會進入酶的活性位點，并立體選擇性地添加到酶形成的類醌XI的Cα碳上，從而形成氮中心自由基XII，這是原生PLP酶學中難以找到的物種。

(fac)-Ir(ppy)³⁺單電子氧化XII生成新的外醛胺XIII，該外醛胺XIII隨后釋放出sp³–sp³偶聯(lián)的ncAA產(chǎn)物III并再生PLP生物催化劑IX，從而完成所有催化循環(huán)。

如果成功進行，這種氧化C(sp³) -C (sp³)交叉偶聯(lián)將使兩種不同的親核試劑結(jié)合，包括容易獲得的有機硼試劑和豐富的氨基酸底物，通過C(sp³) -H功能化邏輯。

此外，如果酶控制的自由基加成和質(zhì)子轉(zhuǎn)移步驟具有良好的立體選擇性，則該α-吡哆醛自由基生物催化將允許制備具有兩個相鄰立體中心的不同ncAAs，具有良好的非立體和對映控制。

圖2 光生物催化不對稱sp³–sp³氧化交叉偶聯(lián)的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化。

在本研究開始時，研究者著手確定合適的PLP生物催化劑，以促進所提出的三氟硼酸芐酯(1a)和甘氨酸(2a，圖2)的光生物催化氧化交叉偶聯(lián)。原則上，絕大多數(shù)能夠形成必要的類醌中間體(XI)的PLP依賴酶都可以被重新利用，以允許氨基酸的自由基α-功能化。

最終，在研究者評價的單電子氧化劑中，Mn(III)， Fe(III)和Co(III)鹽有效地促進了sp³–sp³偶聯(lián)。最終發(fā)現(xiàn)，Co(NH₃)₆Cl₃是最佳的氧化劑。在此條件下，苯三氟硼酸酯1a和苯硼酸松醇酯1a′均能有效轉(zhuǎn)化，且當1a′與2mol % (fac)-Ir(ppy)₃ (4d)偶聯(lián)時，產(chǎn)率提高。

圖3 光生物催化不對稱sp³–sp³氧化偶聯(lián)合成ncAA。

值得注意的是，無需進一步的酶工程，烯丙基硼酸鹽(3r和3s)可以轉(zhuǎn)化為具有良好對映體比例的相應(yīng)的烯基ncAAs。其中，丙烯基硼酸酯(3s)的線性(l)與支鏈(b)的轉(zhuǎn)化比優(yōu)異(大于95:5 l:b)。當羅丹明B (4e)作為光催化劑時，非活化的烷基硼酸鹽(3t)也被酶所接受，使ncAA產(chǎn)物具有良好的對映選擇性，盡管產(chǎn)率很低。

總之，這些結(jié)果表明α-吡哆醛自由基生物催化，在進一步定向進化中具有適應(yīng)廣泛有機硼試劑的良好潛力。重要的是，這種光催化氨基酸合成被發(fā)現(xiàn)是可擴展的。研究者觀察到在10.0 mM的1a ‘濃度下成功制備了1 mmol規(guī)模的3a，而沒有降低生物轉(zhuǎn)化的對映體選擇性。

圖4 β-甲基ncAAs的對映和非對映選擇性合成和α-四取代ncAAs的對映選擇性合成。

研究者測試了他們的PLP自由基酶，使用外消旋仲烷基硼酸鹽以對映趨同的方式形成連續(xù)的立體中心(圖4)。β-甲基ncAAs包含了一個新興的但在很大程度上未知的肽治療化學空間，因為含有這些結(jié)構(gòu)元件的肽具有增強的蛋白水解穩(wěn)定性和結(jié)合親和力。在不操縱保護基團的情況下高效催化不對稱合成鄰α和β-立體中心的ncAAs是藥物化學家面臨的一項重要任務(wù)。

使用外消旋的1-苯乙基三氟硼酸鹽1u作為自由基前體，研究者發(fā)現(xiàn)野生型TmTA能夠通過氧化C-C偶聯(lián)催化合成β-甲基ncAAs，以62%的產(chǎn)率，77:23的非對映比(d.r)和99:1的e.r遞送(2S,3S)-5a(圖4a)。與伯烷基硼試劑的氧化偶聯(lián)不同，對于仲烷基親核試劑，烷基三氟硼酸鹽和4CzIPN的使用，相對于烷基硼酸蒎醇酯和(fac)-Ir(ppy)₃的產(chǎn)率更高。

為了提高這種對映收斂性氧化sp³–sp³交叉偶聯(lián)的催化效率和非對映選擇性，研究者使用反復的位點飽和誘變(SSM)和研究者內(nèi)部構(gòu)建的高通量光化學設(shè)備進行了TmTA的定向進化(圖4a)。

通過兩輪定點飽和突變(SSM)和篩選，TmTA E88T H83F (TmPLP^α₂)以關(guān)鍵α-螺旋上的88和83位殘基為靶點，進化出(2S,3S)-5a，產(chǎn)量為76%，d.r為91:9。在引入的兩個有益突變中，E88T增強了酶活性，而H83F改善了非對異調(diào)控。利用具有對(5b)、間(5c)、鄰甲基(5d)和氟(5e)的TmPLP^α₂，1-苯乙基三氟硼酸酯，可以成功轉(zhuǎn)化為β-甲基苯丙氨酸類似物，收率高，非映對和對映控制效果好(圖4b)。

進一步的研究表明，沒有發(fā)生(rac)-1u的動力學分解，證實了這種生物轉(zhuǎn)化的對映收斂性質(zhì)。通過對其酰胺衍生物7a的單晶X射線衍射分析，確定了5a的絕對立體化學和相對立體化學(圖4c)?？傊?，這種光生物催化氧化交叉偶聯(lián)在一次操作中提供了聚合、立體選擇性和無保護基團的有價值的β-甲基ncAAs合成。

綜上所述，協(xié)同光氧化還原-吡哆醛生物催化，為sp³–sp³氧化偶聯(lián)提供了一個平臺，允許化學或生物學未知的立體選擇性、分子間自由基轉(zhuǎn)化。

【參考文獻】

Wang, TC., Mai, B.K., Zhang, Z. et al. Stereoselective amino acid synthesis by photobiocatalytic oxidative coupling. Nature 629, 98–104 (2024).