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研究背景

隨著對(duì)生物膜電生理學(xué)的深入研究，科學(xué)家對(duì)電壓門控鈉（Nav）通道的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系產(chǎn)生了廣泛的興趣。Nav通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞的膜興奮性中起著關(guān)鍵作用，對(duì)于產(chǎn)生和傳導(dǎo)行動(dòng)電位至關(guān)重要。Nav通道的結(jié)構(gòu)和功能異常與多種疾病，如癲癇、心律失常和疼痛障礙等病理狀態(tài)密切相關(guān)。因此，對(duì)Nav通道的深入理解不僅對(duì)于基礎(chǔ)科學(xué)研究，也對(duì)于疾病治療和藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義。然而，Nav通道的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系以及與不同功能狀態(tài)相關(guān)的構(gòu)象仍然不清楚。尤其是在Nav通道的電機(jī)械耦合過(guò)程中，即在膜電位變化導(dǎo)致通道構(gòu)象轉(zhuǎn)變的機(jī)制中存在很多未知之處。此外，盡管已經(jīng)報(bào)道了幾種Nav通道的結(jié)構(gòu)，但多數(shù)情況下這些結(jié)構(gòu)代表了一種失活狀態(tài)，缺乏不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)信息。

為了解決這些問(wèn)題，清華大學(xué)/深圳醫(yī)學(xué)科學(xué)院顏寧團(tuán)隊(duì)在PNAS在線發(fā)表“Dissection of the structure–function relationship of Nav channels”的研究成果，她們采用了多種策略，其中包括通過(guò)引入點(diǎn)突變來(lái)改變Nav通道的結(jié)構(gòu)，以及引入狀態(tài)依賴性的毒素或藥物來(lái)調(diào)控Nav通道的功能。通過(guò)這些方法，研究人員試圖獲取Nav通道在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)信息，以更全面地理解Nav通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。本研究旨在深入探究人類Nav1.7通道的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。通過(guò)系統(tǒng)地引入突變并解析這些突變體的結(jié)構(gòu)，研究人員試圖揭示不同構(gòu)象與Nav通道功能狀態(tài)之間的聯(lián)系，特別是在通道的激活和失活過(guò)程中。通過(guò)這些結(jié)構(gòu)分析，研究人員解決了Nav通道在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)特征，并提供了對(duì)Nav通道電機(jī)械耦合過(guò)程的新見(jiàn)解。

圖文導(dǎo)讀

為了揭示Nav1.7通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，研究者進(jìn)行了合理設(shè)計(jì)的突變體研究。在該研究中，通過(guò)將人類Nav1.7通道的九個(gè)突變位點(diǎn)替換為NavPaS的相應(yīng)殘基，生成了Nav1.7-M9突變體，該突變體具有更緊密的孔道結(jié)構(gòu)和完全關(guān)閉的門。通過(guò)與WT和M11結(jié)構(gòu)的比較，研究者發(fā)現(xiàn)Nav1.7-M9的整體構(gòu)象介于WT和M11之間，其PD與M11相似，而VSDI和VSDII與WT相似。這表明Nav1.7-M9突變體的結(jié)構(gòu)介于激活態(tài)和靜息態(tài)之間，具有重要的結(jié)構(gòu)和功能特征。此外，通過(guò)HOLE計(jì)算發(fā)現(xiàn)，Nav1.7-M9的孔道收縮點(diǎn)半徑與M11幾乎相同，比WT窄約1.5 ?。這一發(fā)現(xiàn)與先前的分析結(jié)果一致，即在窗口中引入較大的疏水殘基會(huì)增加開(kāi)放孔道的能量壁壘（見(jiàn)圖1）。

圖1. 我們對(duì)Nav1.7變異體的理性設(shè)計(jì)概述

為了研究Nav1.7-M9和Nav1.7-WT之間的結(jié)構(gòu)差異，研究者在圖2A中發(fā)現(xiàn)盡管M9和WT之間的VSDs在整體上相似，但VSDI和VSDII存在輕微的構(gòu)象偏離。具體而言，M9中的VSDI呈現(xiàn)向上的構(gòu)象，而VSDII完全向上。在圖2B中，研究者觀察到PD之間的結(jié)構(gòu)偏差。在M9中，S6II和S6IV段經(jīng)歷了從α到π的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致了S4-5II、S6II和S6III的協(xié)同運(yùn)動(dòng)，以及S4-5I與相鄰的S4-5II和S5II之間的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，盡管M9和WT之間的VSDs保持了相似性，但其PD之間存在顯著的構(gòu)象變化。這些結(jié)構(gòu)差異的發(fā)現(xiàn)為我們深入理解Nav1.7通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供了重要線索，有助于揭示其電機(jī)械耦合的分子機(jī)制。

圖2. Nav1.7-M9和Nav1.7-WT之間的結(jié)構(gòu)差異

研究者為了進(jìn)一步探究Nav1.7通道的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，進(jìn)行了對(duì)Nav1.7-M9和Nav1.7-WT的結(jié)構(gòu)比較與突變分析。圖3分為三個(gè)部分（A、B、C），展示了對(duì)Nav1.7通道突變體的生物物理特性和結(jié)構(gòu)構(gòu)象的詳細(xì)研究。在圖3A中，研究者首先進(jìn)行了對(duì)PD突變的合理性分析，發(fā)現(xiàn)Nav1.7中的九個(gè)突變足以將PD鎖定在緊密的構(gòu)象中。進(jìn)一步的突變分析表明，PD上半部分的突變并沒(méi)有改變主鏈的位置，而下半部分的突變導(dǎo)致了明顯的結(jié)構(gòu)變化，這對(duì)理解PD構(gòu)象的微小差異提供了關(guān)鍵信息。在圖3B中，研究者展示了額外Nav1.7突變體的電生理特性。他們觀察到單點(diǎn)突變L866F或G1454C導(dǎo)致激活電壓依賴性曲線右移，而T870M導(dǎo)致左移。當(dāng)將L866F和G1454C組合在一起時(shí)，激活曲線進(jìn)一步右移。這些結(jié)果揭示了突變對(duì)Nav1.7通道電生理特性的影響，為進(jìn)一步理解Nav通道的功能提供了重要線索。在圖3C中，研究者展示了Nav1.7-M2和Nav1.7-M4的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。通過(guò)電子顯微鏡分析，他們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變體的結(jié)構(gòu)幾乎與WT相同，盡管含有額外的突變。這表明，盡管VSD突變可能引起結(jié)構(gòu)變化，但它們不會(huì)改變PD的構(gòu)象，這對(duì)于理解Nav通道的整體結(jié)構(gòu)具有重要意義。

圖3. 兩個(gè)Nav1.7變體的構(gòu)象與WT相同

研究者通過(guò)圖4展示了Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性增加情況。在圖4A中，研究者通過(guò)比較不同構(gòu)象下的粒子選擇百分位，發(fā)現(xiàn)M9和M11相比M2和M4具有更高的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性。這表明在缺乏任何膜電位的條件下，這兩種突變體具有更大的結(jié)構(gòu)靈活性。進(jìn)一步觀察3D電鏡地圖，研究者發(fā)現(xiàn)突變數(shù)目的增加與S6片段的α → π轉(zhuǎn)變（或者說(shuō)PD的收緊）相關(guān)聯(lián)（圖4B）。在WT中，S6II和S6IV僅由α螺旋轉(zhuǎn)組成。而在M9和M11中，這兩者都在中間螺旋轉(zhuǎn)進(jìn)行了α → π轉(zhuǎn)變。而對(duì)于M2和M4，盡管我們將S6IV建模為α螺旋轉(zhuǎn)，但局部密度的模糊性表明存在另一種構(gòu)象，與存在門控調(diào)節(jié)劑毒素Huwentoxin IV（HWTX-IV）或Protoxin II時(shí)Nav1.7的3D重建中看到的情況類似。這些結(jié)果表明，突變體的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性與PD的收緊以及S6段的α → π轉(zhuǎn)變密切相關(guān)（見(jiàn)圖4）。

圖4. Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的構(gòu)象異質(zhì)性增加

研究者在圖5中展示了Nav通道的PD的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。圖5A展示了PD的三種解析狀態(tài)：放松、中間和緊密。放松的PD具有四個(gè)窗孔和類固醇樣分子穿透的特征，而緊密的PD則具有封閉的細(xì)胞內(nèi)門和縮小的或封閉的窗孔。圖5B展示了非導(dǎo)電PD可能對(duì)應(yīng)的多種構(gòu)象，其中M9和M11顯示了緊密PD，而WT則顯示了放松的PD。通過(guò)比較Nav1.7-M9、M11、WT和HS-π的PD孔徑，揭示了PD的多種構(gòu)象。圖5C預(yù)測(cè)了未來(lái)可能被結(jié)構(gòu)解析的Nav變異體的電生理特性。具有右移的激活曲線和進(jìn)一步右移的靜態(tài)失活曲線的變體可能代表靜息態(tài)構(gòu)象。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于理解Nav通道的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系以及揭示靜息態(tài)構(gòu)象的建模具有重要意義。

圖5. Nav通道PD的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系

結(jié)論與展望

本文揭示了電壓門控離子通道（VGICs）結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，特別是鈉離子通道（Nav）的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)性如何影響其生理活性。通過(guò)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)分析和電生理實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)不同Nav通道變體在結(jié)構(gòu)上的微小差異會(huì)導(dǎo)致電生理特性的顯著變化，這對(duì)于理解離子通道的活動(dòng)機(jī)制至關(guān)重要。

此外，研究者們提出了一種通過(guò)結(jié)構(gòu)解析Nav通道不同狀態(tài)的方法，進(jìn)一步揭示了Nav通道的工作周期，特別是其靜息狀態(tài)的結(jié)構(gòu)特征。這些發(fā)現(xiàn)不僅為了解生物膜電位調(diào)控和神經(jīng)傳導(dǎo)提供了重要線索，還為設(shè)計(jì)更精確的離子通道藥物靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。因此，本研究為進(jìn)一步探索離子通道的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系以及神經(jīng)元興奮性調(diào)控的分子機(jī)制提供了重要的科學(xué)啟示。

原文詳情：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2322899121

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